QX200数字PCR仪操作指南：从样品准备到结果分析的全流程

　　QX200数字PCR仪采用第三代PCR技术，能够对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，无需标准曲线即可直接获得靶标分子的起始拷贝数或浓度。该系统具有高灵敏度、高精确度和高重复性，广泛应用于癌症生物标志物研究、病原体检测、基因表达分析等领域。

　　一、操作前准备

　　1.设备检查与预热：QX200数字PCR仪开机前需检查电源连接是否牢固并可靠接地。先打开电源，预热至少30分钟后打开电脑和QuantaSoft软件。建议每次实验之前做一次Flush System，若一周以上未使用建议先做一次Prime再做Flush System。

　　2.耗材准备：准备DG8 Cartridges（微滴发生卡）、DG8 Gaskets（密封垫）、Droplet Generator oil（微滴生成油）、ddPCR Supermix预混液、Pierceable Foil Heat Seal（热封膜）等耗材。

　　二、反应体系配制

　　1.探针法反应体系：配制20ul探针法定量反应体系，选用适宜的探针法预混液。推荐终浓度900nM Primer+250nM Probe，振荡混匀，离心除气泡。注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围。

　　2.染料法反应体系：选用QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，推荐终浓度100nM Primer，单孔模板检测范围为1~30000拷贝片段化核酸或1~20000拷贝完整基因组DNA。用质粒作为模板时建议酶切以消除复杂结构，做CNV实验时必须对DNA模板进行高频酶切。

　　三、微滴生成步骤

　　1.放置耗材：将一个新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向。将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内，不足8个样品时用稀释一倍的20ul 1×buffer control补足。建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈约15°角，缓慢打出液体。

　　2.加入微滴生成油：在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油（DG Oil），同样不能有空着的孔。盖上胶垫（gasket），注意两边的小孔都要钩牢。

　　3.生成微滴：将holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，建议使用Rainin的8通道P-50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40ul。

　　四、PCR扩增与封膜

　　1.转移油滴：将holder放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔底约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内约5秒，枪头贴近孔壁接近孔底。注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫。

　　2.热封处理：转移油滴进入96孔板内完成后，将膜有红线标记的一面（反光亮面）朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜。推荐的运行程序为180℃、5-10秒，无需颠倒方向进行二次封膜。

　　3.PCR反应：封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。探针法推荐反应条件：95℃ 10min；94℃ 30s 40循环 Tm；98℃ 10min。

　　五、微滴检测与分析

　　1.样品板放置：将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位。组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。

　　2.软件操作：打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，主要是提供实验名称、实验类型（ABS、CNV、RED）、assay以及探针信息等。完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实修正后保存结果，即完成了一次QX200实验。
 

　　六、注意事项

　　1.样品质量要求：RNA或反转录的cDNA样本，样本cq值应>28；DNA样本需进行限制性内切酶酶切，总量不超过100000个拷贝；自带引物和探针，荧光染料法引物工作浓度100nM，探针法引物浓度900nM、探针浓度250nM。

　　2.操作规范：加样时避免引入气泡，不要将枪打至第一档位置；微滴生成过程中注意指示灯状态；封膜后应尽快进行PCR反应；使用配套的AutoDG吸头，其他品牌吸头会对仪器造成损伤。

　　QX200数字PCR仪通过将反应体系分割为大量独立微滴，实现了对目标分子的绝对定量，具有无需标准曲线、灵敏度高、抗干扰能力强等优势，是生命科学研究中的重要工具。